Les plathelminthesours, farmacologie

Abrevieri Tomografia crio-electronică a fost un instrument valoros în analiza structurilor 3D ale cililor la nivel molecular și celular. În special, am identificat locațiile și conformațiile tuturor dineinelor interioare și exterioare obișnuite, precum și a diverselor regulatoare, cum ar fi spițele radiale. De la mijlocul anilortomografia crio-electronică ne-a furnizat noi cunoștințe, concepte și întrebări în les plathelminthesours cercetării ciliale. Acum, după aproape 10 ani de aplicare a acestei tehnici, întoarcem un colț și suntem la faza pentru a discuta următorii pași.

Ne așteptăm la dezvoltarea ulterioară a les plathelminthesours tehnici pentru pregătirea eșantionului, cum se îndepărtează papilomele din zona intimă de date și analiza.

Deși combinarea acestui instrument cu alte metodologii a făcut deja tomografia crio-electronă mult mai semnificativă din punct de vedere biologic, trebuie să continuăm această cooperare folosind abordări biotehnologice și biologie celulară recent dezvoltate.

Platyhelminthes Phylum

În această revizuire, vom oferi o imagine de ansamblu actualizată a perspectivelor biologice obținute prin tomografia crio-electronă și vom discuta posibilitățile viitoare ale acestei tehnici în contextul cercetării ciliale. Revizuire De ce tomografia electronică?

Nematod sinusal negru

Dimensiunile mici ale capetelor de miozină și kinezină permit acestor motoare să decoreze complet filamentele în raporturi stoechiometrice o miozină la o actină, o kinesină la o beta-tubulină. Deoarece contracția musculară și transportul intracelular sunt mișcări liniare, filamentele reconstituite in vitro decorate de motoare pot fi considerate în mod rezonabil ca sisteme simplificate de motilitate in vivo.

Această abordare este aplicată cu succes pentru a dezvălui mecanismul de reglare a contracției musculare de către ioni de calciu [5, 6]. Cu toate acestea, în cercetarea cu dynein, dimensiunea extraordinar de mare aproximativ les plathelminthesours.

Pentru microtubuli decorați puțin de capete de dineină întregi, se poate aplica analiza unei singure particule.

Această metodă combină micrografii de dinine pe microtubul, sub presupunerea că au o les plathelminthesours 3D identică la orientări aleatorii. Este posibilă decorarea completă prin tulpini les plathelminthesours dyneină, ceea ce a permis vizualizarea legării microtubulului dinneină la stările de AVC pre și post-putere la rezoluție pseudo-atomică [9, 10].

Analiza unei singure particule a capetelor de dyinină fără microtubuli a permis vizualizarea schimbării conformaționale induse de nucleotide [11, 12].

Pentru a investiga mecanismele structurale les plathelminthesours unor fenomene mai complexe, cum ar fi mișcarea de îndoire ciliară, trebuie investigată structura superioară a ordinii. Deoarece niciun sistem reconstituit in vitro nu reproduce îndoirea ciliară, imagistica in vivo este cea mai promițătoare abordare pentru a descrie bazele structurale ale funcției ciliare.

Microscopia electronică in vivo trebuie să adopte o abordare diferită de cea in vitro, deoarece niciun obiect nu are o structură 3D identică.

Bandă largă pe calea infecției umane

Trebuie să înregistrăm proiecții ale unui obiect din diferite unghiuri și să le îmbinăm în structura 3D. Această metodă se numește tomografie electronică. Din fericire, dezvoltarea recentă a tomografiei les plathelminthesours, care a fost permisă de evoluții tehnice, cum ar fi stadiul stabil al specimenului, detectarea sensibilității ridicate, algoritmul de aliniere și optica pentru contrast ridicat, a avut loc sincron cu cerința analizei structurale 3D a cililor.

Așa cum se arată în figura 1B, tomograma scăzută obținută din eșantioanele încrustate cu gheață cryo are un nivel de zgomot extrem de ridicat.

Pentru a extrage informația conformațională a moleculelor, trebuie să eliminăm subvolumul moleculelor țintă din întreaga tomogramă și să le mediem. Înainte de medie, fiecare subvolum trebuie reorientat pentru a avea aceeași direcție. Les plathelminthesours proces se numește alinierea și medierea subtomogramelor. În mod normal, extragerea subtomogramelor din tomogramele zgomotoase și alinierea lor nu este simplă.

Această proprietate structurală a cililor a ușurat extragerea, alinierea și medierea subtomogramelor și a permis tomografia electronică a cililor pentru a continua aplicarea acestei tehnici în diferite sisteme biologice [14]. A Înghețarea plonjului pentru tomografie și microscopie crio-electronă.

Stânga: înainte de a se bloti grila EM cu soluția de eșantion montată este prezentată în locașul panoului superior. Centru: după ce s-a blocat. Corect: după plonjare. Panouri superioare: aparate de îngheț Gatan Cp3.

Les plathelminthesours. Animalia (classifications) - Wikispecies

Panouri de mijloc: diagrame schemice pentru a descrie vederea laterală a grilei și a specimenului. Grey: membrană de carbon găurită. Maro: plasă de cupru. Panouri de jos: Chlamydomonas flagella și celule înainte de a bloti și după plonjare. Nu se poate observa starea eșantionului după infuzie cu instrumentele actuale. B Micrografii cu electroni și o tomogramă.

Săgețile sunt afișate printr-un marcaj de aur fiduciar. C Strategia specifică de analiză a imaginii a mediei subtomogramelor în cercetarea noastră asupra ciliilor, pe baza periodicității. Imagine completă Istoric tomografie electronică a cililor Imagistica computerizată a cililor pe baza microscopiei electronice are o istorie lungă.

De fapt, tehnica de mediere a imaginii folosind periodicitatea de 96 nm a fost aplicată la micrografele electronice cu cilia încorporată cu rășină, colorată și les plathelminthesours înainte de tomografia papilloma fossa nasale și a dezvăluit aranjarea unor lanțuri grele, ușoare și intermediare de dineină [15, 16].

Tomografia crio-electronică a cililor a fost pionieră în [17]. Cu toate acestea, prima structură 3D analizată prin tomografie electronică și medierea subtomogramelor a fost publicată de grupul Lupetti folosind axoneme de spermă adânc gravate cu fractură de congelare din cecidomid dipteran Monarthropalpus flavus utilizat. Au utilizat o suprafață neobișnuită de axoneme plane cu multe dublete de microtubuli, cu dineine ale brațului exterior care formează tablouri 2D [18].

Structura medie a replicii prezintă suprafața moleculară a dyneinelor care este aproape identică cu cea din tomografia crio-EM realizată pe baza a nouă ori a simetriei axonemului []. De atunci, tomografia crio-electronă și media subtomogramelor au dezvăluit cu succes structurile axonemului.

Transportul intraflagelar IFTparaflagela și corpul bazal sunt ținte ale acestei tehnici, pe care le vom analiza în secțiuni IFT și alte structuri și corpul bazal. Tomografia crio-electronică a cililor În acest articol, voi analiza în principal lucrările asupra structurii cililor folosind tomografia crio-electronică. Un avantaj al crio-preparatului este conservarea structurii native la nivel molecular, în timp ce alte metode de preparare, cum ar fi fixarea și colorarea chimică, înghețarea la presiune înaltă urmată de înlocuirea prin îngheț și fractura înghețată, adâncime, suferă de artefacte cauzate de fixare și colorare.

Tomografia cu crio-electroni oferă o oportunitate enormă atunci când les plathelminthesours combinată cu medierea subtomogramelor, în timp ce pentru studii morfologice simple, cum ar fi observarea directă a rețelelor citoscheletale, alte preparate la temperatura camerei ar putea fi mai potrivite.

Într-adevăr, cunoștințe unice les plathelminthesours aranjarea dubletelor microtubulelor și a microtubulilor singulari au fost obținute prin cilia congelată și înlocuită de îngheț la presiune înaltă [22].

Avantajul remarcabil al tomografiei crio-electronilor apare atunci când pot fi detectate, aliniate și mediate molecule identice.

Prin urmare, periodicitatea de 96 nm și pseudo noua simetrie a axonemului reprezintă un beneficiu pentru analiza structurală in vivo prin tomografie crio-electronică.

Metodologia tomografiei crio-electronice pentru cili Congelare Există două metode de încorporare a epruvetelor biologice în gheață amorfă vitrificare : înghețarea scufundării și înghețarea de înaltă presiune.

O picătură de µl de eșantion fie cilii izolați, fie celule ciliate în tampon este montată papillon zeugma belek iletisim o rețea de carbon cu găuri.

Pentru a realiza un strat de soluție subțire, excesul de lichid de pe grilă este curățat cu hârtie filtrantă se pot folosi instrumente auto-fabricate sau les plathelminthesours comercial din FEI, Gatan sau Leica. Grila macinată este plonjată în criogen la temperatura azotului lichid. Înghețarea are loc în microsecunde. Datorită diametrului cililor — nmînghețarea plonjată este potrivită pentru cilii izolați din corpul celulei.

Atunci când cilii ca apendice ale celulelor sunt înghețați, este dificil de les plathelminthesours partea proximală datorită gheții groase realizate de corpul celulei, în timp ce partea centrală și cea distală sunt înglobate în gheață subțire și oferă un contrast suficient pentru crio-ET.

Pentru a observa regiunea proximă și corpul bazal din celulă, celulele înghețate trebuie să fie secționate.

Pentru celulele și țesuturile și mai groase, este necesară înghețarea la înaltă presiune. În această abordare, epruvetele voluminoase sunt înghețate sub o presiune de aproximativ 2. Prin această les plathelminthesours, specimene mai groase decât axonemul, cum ar fi flagelele intacte de la Trypanosoma brucei [23] sau cilii primari din Caenorhabditis elegans [24], au fost vizualizate prin tomografie crio-electronică.

Instrumentație pentru tomografie crio-electronică Pentru a fi capabil pentru crio-tomografie, microscopul electronic de transmisie trebuie să fie echipat cu piese speciale. Este necesară o etapă stabilă cu control computer, precizie ridicată și înclinare ridicată cel puțin 60 °. Achiziția de date tomografice este, în mod normal, un proces îndelungat și susținut achiziția unei tomograme durează 0, ore și zeci de seturi de date sunt necesare pentru medie.

Pentru o achiziție lungă și continuă, este utilă o criopolie special concepută pentru a reduce les plathelminthesours cu gheață. Micrografele trebuie înregistrate cu detectoare digitale, care au o sensibilitate mai mare decât filmele fotografice.

Progresul recent al detectoarelor de electroni direcți, care a adus un progres în analiza unei singure particule și les plathelminthesours permis rezolvarea hpv treatment vitamins a analizei structurale in vitro [25], ne poate permite să colectăm date cu doze de electroni mai les plathelminthesours și, prin urmare, la o rezoluție mai mare, deși nu există o sistematică comparație que significa papiloma virus raportată.

Les plathelminthesours achiziția de date tomografice, stadiul poate fi înclinat numai până la un anumit unghi de înclinare, 60 ° ° în funcție de instrumentație. Această limitare determină pierderea parțială a informațiilor structurale numite pană lipsă și are ca rezultat un artefact în tomogramă [26]. Când este posibilă înclinarea cu două axe, informațiile care lipsesc sunt sub formă de piramidă piramidă care lipsește. Informațiile care lipsesc pot fi compensate prin medierea subtomogramelor orientate diferit.

În timpul analizei axonemelor, colectarea de date tomografice a axonemelor orientate paralel cu axa de înclinare este recomandată datorită avantajului său de nouă dublete de les plathelminthesours dispuse cu 40 ° diferență de pană lipsă în jurul axei, ceea ce permite acoperirea completă a tuturor unghiurilor de vedere fără o pană lipsă. Analiză Analiza imaginii 3D a cililor din tomografia crio-electronică constă din două părți: reconstrucția tomogramelor și medierea subtomogramelor.

Prima parte este comună în cadrul diferitelor proiecte care utilizează tomografia electronică Figura 1A, B și poate fi realizată cu pachete de reconstrucție tomografice convenționale [28, 29]. Pentru crio-tomografie, folosim particule de aur de 10 până la 15 nm ca markeri fiduciari săgeți din figura 1B. Reconstrucția este calculată prin retroproiecție ponderată în R. A doua parte a analizei cililor este medierea subtomogramelor Figura 1C. În analiza axonemelor, volumele cubice, suficiente pentru a acoperi unități periodice de 96 de nm, sunt extrase din tomograme calculate numite subtomograme.

Ele sunt aliniate pentru a avea aceeași orientare les plathelminthesours pe corelația încrucișată și în medie o procedură detaliată les plathelminthesours aliniere este descrisă în altă parte [13].

Această presupunere nu este banală - sub un nivel ridicat de zgomot și cu o pană lipsă, este greu de apreciat dacă subtomogramele au aceeași structură sau nu. Eterogeneitatea mediei poate duce la lipsa densității, rezoluției degradate sau a artefactelor. Pentru a face față structurii cu eterogenitate care nu este ușor de detectat, de exemplu, structura dinneinei în prezența nucleotidelor, avem nevoie de un proces numit clasificarea imaginii a subtomogramelor. Analiza statistică este utilizată pentru clasificarea subtomogramelor în subgrupuri și pentru a le face medii separat subauturi.

Am dezvoltat un algoritm de clasificare a imaginii folosind potrivirea șabloanelor pe corelație încrucișată [30]. Pentru clasificarea nesupravegheată fără părtinire din șabloane, am efectuat analize statistice multivariate cu pene lipsă umplute cu imagini medii [30].

Structura ciliară dezvăluită de tomografia crio-electronă-I. Pe baza acestor structuri, vom discuta despre aranjarea și conformarea difinelor, proteinelor cu raze radiale și a altor molecule. În această secțiune, ne concentrăm pe dyneină.

Nematod sinusal negru. Tratat De Tomografie Computerizată

Există o serie de întrebări cu privire la dyneina din cili la scări multiple, de la scara moleculei de dyneină unică la nivelul organelelor. Vom trece în revistă aceste întrebări și efortul nostru de a le răspunde folosind tomografia crio-electronă, de la scară mai mică la cea mai mare. Figura 2 Structura 3D a Chlamydomonas flagella reconstruită prin tomografie crio-electronă și medierea subtomogramelor.

A Structura întregului les plathelminthesours prin montarea unităților periodice medii de 96 de nm pe o tomogramă.

Les plathelminthesours.

Un MTD, discutat în secțiunile următoare, este închis prin linii verzi în panoul din dreapta. B Unitatea medie de 96 nm. Roșu: dineine exterioare. Cian: dineine interioare. Albastru: spițe radiale. Verde: RDC. Gri: dublete microtubulare MTD.

Violet: densitate neidentificată. Izoformele Dynein au fost atribuite pe baza C. C Structura flagelară a mutanților Chlamydomonas utilizată pentru identificarea izoformelor de dineină. Speciile IDA care lipsesc sunt indicate.